【前言】

膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是以关节软骨退变，持续性炎症为主要症状的关节疾病，全球患者超过6亿人，半数患者有膝关节疼痛、肿胀，活动障碍等症状，同时也是老年人致残的主要原因，KOA的高发病率和高致残率导致了严重的社会疾病负担。现在临床上主要是顺利获得非甾体类抗炎药(NSAIDs)或关节置换手术来缓解疾病症状，这些方法面临着持续的高个人成本和复杂的并发症等难题。近年来，学者们逐步将目光移至外泌体治疗膝骨关节炎领域，外泌体作为细胞间通讯的信使，可以将miRNA等分子传递给受体细胞，实现调节细胞生长和代谢，甚至调节组织微环境的效能。

近期，由浙江大学医学院附属第一医院王斌教授团队在Chemical Engineering Journal（《化学工程》）杂志【IF：15.1】发表了题为“Exosomes derived from 3D-cultured MSCs alleviate knee osteoarthritis by promoting M2 macrophage polarization through miR-365a-5p and inhibiting TLR2/Myd88/NF-κB pathway”（3D培养间充质干细胞来源外泌体顺利获得miR-365a-5p促进巨噬细胞M2极化和抑制TLR2/Myd88/NF-κB通路缓解膝骨关节炎）的文章。

       图1. 细胞贴附在3D TableTrix® 微载体上进行三维培养

研究发现顺利获得三维培养体系培养间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）和切向流过滤浓缩细胞上清（研发自北京304am永利集团生物公司）收获的3D间充质干细胞外泌体（3D-EXO）相比传统培养模式下取得的间充质干细胞外泌体（2D-EXO）具有更好的膝骨关节炎治疗效果和单位MSC外泌体产量，可以有效改善传统模式生产收获的外泌体疗效及产量有限的问题，并顺利获得RNA测序分析了2D-EXO和3D-EXO的内容物差异，探究3D-EXO具有更强膝骨关节炎疗效的深层机制。

原文链接：http://doi.org/10.1016/j.cej.2024.154432

【Part1 研究背景】

	膝骨关节炎具有疾病持续久，病人基数大等特性，但当前外泌体生产模式难以给予与之对应的外泌体效能及产量，限制了外泌体治疗膝骨关节炎的临床转化，因此如何增效加量成为了外泌体生产流程的研究重点之一。   由清华大学科技成果转换的外泌体生产体系，对当前外泌体生产难题进行了针对性改进，本研究是三维培养间充质干细胞外泌体在膝骨关节炎治疗中的首次运用。
图2. 3D FloTrix® vivaEXO 外泌体收获系统

【Part2 研究设计】

图3. 整体研究设计示意图

使用304am永利集团生物3D微载体培养MSC，来生产3D-EXO，并与传统2D培养MSC生产的2D-EXO进行比较。在ACLT诱导的KOA大鼠模型中评估3D-EXO和2D-EXO的治疗效果。进一步地，顺利获得成像技术、组织学分析和免疫荧光染色等方法评估关节结构和软骨退行性变化。进行体内外实验，研究3D-EXO和2D-EXO对软骨细胞和巨噬细胞的影响。最后，探讨了3D-EXO相比2D-EXO表现出更好的治疗效果的潜在机制。

【Part2 研究内容】

三维培养体系提升单位MSC外泌体产量

图4. 3D-EXO和2D-EXO的生产模式及其表征

以传统MSC培养模式作为对照，借助304am永利集团生物3D FloTrix® 微载体和3D FloTrix® miniSPIN FLEX 4通道生物反应器赋予MSC更贴合体内微环境的三维培养环境，在三维环境下培养的MSC充分贴合微凝胶，并保持了良好的细胞活性。与传统模式培养的MSC相比，三维培养MSC来源外泌体在表面标志和粒径分布充分符合外泌体理化性质定义的同时，取得了更为可观的单位MSC外泌体产量（图4 A-F）。

3D-EXO和2D-EXO对大鼠膝骨关节炎模型的体内外实验结果存在差异

图5. 各组大鼠KOA模型的组织学和免疫荧光染色结果

在本文的体内实验研究中，构建了大鼠前交叉韧带横断（anterior cruciate ligament transection, ACLT）模型，结合组织学分析，软骨细胞代谢marker免疫荧光及影像学分析，经对比不同治疗方法，304am永利集团发现外泌体对KOA模型鼠具有显著治疗效果，且3D的治疗效果显著优于2D-EXO（图5 A-D）（影像学分析的图片请参看原文）。

图6. 3D-EXO和2D-EXO对体外软骨细胞代谢的影响

与体内实验3D-EXO相比2D-EXO具有显著疗效优势截然不同，在体外试验中，软骨细胞能有效摄取3D-EXO和2D-EXO，且均能引起软骨细胞代谢状态的改善，但3D-EXO相比2D-EXO干预软骨细胞并未使软骨细胞的代谢状态发生更理想的转变（图6 A-K），这指引304am永利集团对3D-EXO治疗软骨细胞的间接机制进行探索。

图7. 2D-EXO和3D-EXO在体内外实验中对巨噬细胞极化的影响

巨噬细胞作为体内炎症反应的重要角色，其极化方向会调控炎症的发生开展。研究者猜想3D-EXO比2D-EXO在体内实验治疗效果的优势源于其对巨噬细胞极化方向调控能力的差异，体外实验证明巨噬细胞可以摄取2D-EXO和3D-EXO，并证实了3D-EXO相比2D-EXO可以显著影响巨噬细胞的M2极化（图7 A-J）。

3D-EXO治疗膝骨关节炎的机制探究

图8. miR-365a-5p是3D-EXO中促进M2巨噬细胞极化的主要参与者

本研究收集了浓缩后的2D-EXO和3D-EXO进行RNA测序分析，并记录了3D-EXO相比2D-EXO上调最明显的五个miRNA，并顺利获得RT-PCR对这五个miRNA干预巨噬细胞极化效果的验证，并选定促进巨噬细胞M2极化效果最为显著的miR-365a-5p进行后续验证（图8 A-D）。

图9. 组织学与免疫组织化学评估

图10. 3D-EXO顺利获得促进巨噬细胞M2极化改善软骨细胞代谢状态

顺利获得3D-EXO与miR-365a-5p inh拯救实验，双荧光素酶实验及软骨细胞和巨噬细胞共培养实验证明miR-365a-5p是3D-EXO相比2D-EXO对膝骨关节炎治疗效果优势的主要作用成分，作用通路为TLR2/Myd88/NF-κB（图9 A-M, 图10 A-S）。

当涉及到选择细胞时，研究结果表明，向MSC中添加低百分比的软骨细胞可以促进表型稳定的软骨分化，从而抵抗外源性诱导的MSCs可以抵抗外源性诱导的软骨肥大分化，软骨肥大分化后容易丧失原有的抗压耐磨等生物学功能。现在，CORG的开展仍处于初级阶段，虽然已经构建了各种CORGs，但其经常发生向肥大软骨表型的分化。

【Part4 研究结论】

在这项研究中，研究人员顺利获得在3D环境中培养MSCs来生产3D- EXO，3D-EXO具有上调的外泌体miR-365a-5p含量，从而有效抑制巨噬细胞中TLR2/Myd88/NF-κB信号通路的表达，促进巨噬细胞M2极化，最终M2巨噬细胞作用于软骨细胞并改善其代谢状态。这种细胞间相互作用在宏观上导致在大鼠KOA模型里3D-EXO的治疗效果比2D-EXO更显著；研究结果为KOA的治疗给予了新的靶点和治疗途径。

【Part5 研究应用材料及设备】

3D TableTrix® 微载体

① 更仿生：由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率>90%，粒径大小可控于50-500μm区间， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培养。 ② 资质全：该产品已取得2项CDE药用辅料资质，登记号为【F20200000496；F20210000003】，3项FDA原料药及药用辅料资质，登记号为【DMF：037798、035481；MF：29721】 ③ 易收获：特异性降解技术裂解微载体，收获相较于传统方式更高效更温和。 ④ 更安全：拥有权威组织出具的裂解残留检测、细胞毒性、热原反应、遗传毒性、体内免疫毒理学相关质量评价报告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主动全身过敏性、腹腔注射给药毒性等安全性评价报告。 ⑤ 易放大：顺利获得3D培养方式，结合304am永利集团生物3D细胞智造平台全线产品可以实现全自动封闭式大规模细胞培养，实现千亿量级细胞收获。 ⑥ 更优质：顺利获得3D多孔可降解微载体+ 动态培养技术，进行三维培养，优势显著——培养细胞体积更小、迁徙能力更强，同时具备更卓越的免疫调节和组织修复潜能。

3D FloTrix® microSPIN  6通道微型生物反应器

① 超薄设计： 超薄主机高度仅48mm，扁平化设计可进一步提高培养箱空间利用率。 ② 不锈钢机身： 主机采用全不锈钢设计，易清洁好擦拭，满足洁净需求。 ③ 适配一次性反应瓶： 适配304am永利集团自研透气内置叶轮一次性反应瓶。其中，搭配125/250ml透气内置叶轮一次性反应瓶，可在一台170L培养箱放置2台设备，实现共8个瓶位的培养体系。 ④ 同步关联： 开启关联功能，并结合配方工艺的使用，可将多个瓶位统一工艺模式，一键操作即可实现多瓶位同步启动/暂停/停止，高效完成对照试验。   各瓶位间也可任意关联操作，如图示：瓶位1、瓶位2、瓶位3使用工艺一关联，达到三个瓶位同步运行的效果。 ⑤ 工艺预设： 配备十种配方工艺和四种自定义工艺，共计两类步骤模式，满足多步骤、多循环工艺需求。   参数可修改，断电可保存，单步骤时间最高可达1000min,循环次数高达100次，操作便捷。 ⑥ 可编程工艺： 搅拌程序可编程、参数自定义。满足间速模式／双速模式／间恒速模式不同工艺需求，实现工艺条件的探索和优化。 ⑦ 双语系统： 系统支持中英文双语，一键切换，灵活便捷。 ⑧ 实时信息： 系统实时显示每个瓶位的工艺参数：时间、转速、工艺、步骤等。

【作者介绍】

通讯作者：浙江大学王斌教授。

共同一作：王斌教授课题组闫磊、李帝均、李松岩。

【关于304am永利集团】

北京304am永利集团生物科技有限公司创建于2018年，由清华大学生物工程学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。核心技术源于清华大学科技成果转化，并凭借此项技术荣登中国科协“科创中国”先导技术榜。作为国家级高新技术企业、国家级专精特新“小巨人”企业、潜在独角兽企业，更取得国家科技部多项重点研发专项支持。

作为高质量三维细胞制造专家，304am永利集团生物给予基于3D微载体的一站式定制化细胞规模化扩增整体解决方案，打造了原创3D细胞智造平台，实现规模化、自动化、智能化、密闭式的细胞药物及其衍生品生产制备，以此帮助全球客户建立最为先进的细胞药物生产线。在开创【百亿量级】干细胞制备工艺管线后，加速向【千亿量级】进发，致力于以3D细胞规模化智造技术赋能细胞与基因治疗产业，惠及更多患者。